學習外源DNA匯入原核生物細胞的方法
方法/步驟
實驗目的
學習外源DNA匯入原核生物細胞的方法
實驗內容
熱激處理將外源質粒dna匯入原核細胞。
實驗原理
利用CaCl2處理感受態體細胞，然後通過熱休克處理，即置於42℃高溫熱激90秒，熱休克後，需要使受體細胞在不含有抗生素的培養液中生長至少半小時以上，使其表達足夠的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生長菌落。
實驗方法與步驟
1、 製備含有Amp抗生素的LB平板。
2、 取一個1.5ml離心管，加入100μl感受態細胞懸液，置冰上：加入20ul質粒T+G(提取的質粒DNA稀釋500X)，用移液器輕柔混勻。冰上靜置20min。
3、 42℃水浴中熱激90秒，然後迅速置冰上3~5min。整個過程不要振盪菌液。
4、 加入1ml LB液體培養基(不含抗生素)，混勻後37℃振盪培養(180rpm)1小時，使細菌恢復正常生長狀態，並表達質粒編碼的抗生素抗性基因。
5、 取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固體培養基上，塗布均勻。
6、 待菌液被培養基吸收後，37℃倒置培養12~16小時，菌落生長良好而又未互相重疊時，取出。
7、 計算轉化率
8、 統計每一個培養皿中的菌落數。
9、 轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
10、 轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/塗板菌液體積;
11、 轉化頻率(轉化子數/μg質粒DNA)=轉化子總數/質粒DNA加入量(μg)