間充質幹細胞培養細胞誘導分化時必然用到的就是培養液,配置出合適的培養液能夠促進細胞的分化,因此這一步操作時相當的關鍵。如何才能配置適合的誘導培養液呢?濟南中賽生物來介紹成骨與成脂誘導培養液的配備方法。
成骨誘導培養液配備與誘導操作:
1.準備含10%FBS的α-MEM培養液;
2.在備好的α-MEM培養液中新增50μM 抗壞血酸, 10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松;
3.準備6孔培養板,將P4細胞按照5×103個/平方釐米的規格接種於原始α-MEM培養液中;
4.待細胞長至基本融合後,更換上述製備完成的成骨誘導培養液;
5.每三天換液一次,細胞長至7天時進行鹼性磷酸酶染色;
6.二十八天後再進行礦化結節的茜素紅染色。
茜素紅染色方法介紹:
1.去除細胞當前使用培養液,使用PBS清洗兩次;
2.使用10%甲醛室溫固定15分鐘,完成後使用重蒸餾水沖洗兩次;
3.按照1ml/孔加入40mM的茜素紅染色液,室溫孵育20min並輕微振盪;
4.清除掉沒有完全結合的染料,用重蒸餾水漂洗並振盪5min重複4次;
5.傾斜放置2min,吸取多餘的重蒸餾水;倒置顯微鏡觀察拍照記錄。
成脂誘導培養液配備與誘導操作:
1.配置FBS10%含量的HG-DMEM培養液;
2.在配製完成的HG-DMEM培養液中加入1μM地塞米松,10μg/ml胰島素,200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX;
3.準備6孔培養板,將P4細胞按照2×104個/平方釐米的規格接種於原始HG-DMEM培養液中
4.待細胞長至基本融合後,更換上述製備完成的成脂誘導培養液培養2天,在用只含有10μg/ml胰島素的成脂維持培養液培養1天,如此交替迴圈培養至14天,使用紅油O染色。
紅油O染色方法介紹:
1.去除細胞使用的當前培養液,使用PBS清洗兩次;
2.27.5%甲醛室溫固定20分鐘;
3.重蒸餾水清洗3此,空氣中乾燥;
4.加入0.5%的紅油室溫孵育一小時;
5.配製70%乙醇溶液清洗3次;
6.倒置顯微鏡觀察拍照記錄。